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1,2-二氯乙烷亞急性暴露對大鼠抑郁樣行為 及單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響
點擊次數(shù):1872 更新時間:2019-07-30

目的探討1,2-二氯乙烷1,2-DCE)亞急性暴露對大鼠抑郁樣行為的影響及其可能單胺神經(jīng)遞質(zhì)的作用 機制方法無特定病原體級雄性SD大鼠隨機分為對照組和低、、高劑量組,每組10,分別予0、20、40

80 mg/kg體質(zhì)量1,2-DCE(以玉米油稀釋)灌胃染毒,21,連續(xù)染毒14。染毒結(jié)束后,采用曠場實驗、

糖水偏愛實驗和強迫游泳實驗觀察大鼠行為學變化情況,采用液相色譜-電化學檢測法測定大鼠大腦前額皮 層、海馬、紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)去甲腎上腺素(NA)和多巴胺水平。結(jié)果與對照組比較,

高劑量組大鼠直立次數(shù)、中心區(qū)域活動時間和路程均減少P <0.05),糖水偏愛度下降P <0. 05),強迫游泳實 驗中不動時間延長P<0. 05)。大鼠前額皮層、海馬、紋狀體內(nèi)5-HT、NA和多巴胺水平均隨著1,2-DCE染毒劑量 的增加而下降P <0.05),呈劑量-效應關(guān)系。高劑量組大鼠前額皮層、海馬、紋狀體內(nèi)5-HT、NA和多巴胺水平均 低于對照組P<0. 05)。結(jié)論1,2-DCE亞急性暴露可誘導大鼠抑郁樣行為,其機制可能與降低前額皮層、海馬、

紋狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平相關(guān)。

關(guān)鍵詞:1,2-二氯乙烷;抑郁癥;單胺類神經(jīng)遞質(zhì);5-羥色胺;去甲腎上腺素;多巴胺;行為學;大鼠

 

  • 二氯乙院(1,2~dichloroethane, 1,2-DCE)是工 業(yè)上用途廣泛的有機溶劑,其屬高毒類神經(jīng)性毒物; 在職業(yè)活動過程中短時間大量接觸1,24)CE可導致 職業(yè)性急性或亞急性1,2-)CE中毒,其主要靶器官是 中樞神經(jīng)系統(tǒng)。行為功能改變是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)在受 損的外部表現(xiàn),神經(jīng)損傷引起的行為學的改變可作為 反映神經(jīng)毒性的評價指標。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,神經(jīng) 遞質(zhì)對突觸信息的傳遞起到興奮性或抑制性的作用, 主要包括單胺類遞質(zhì)、氨基酸類遞質(zhì)、膽堿類遞質(zhì)和 神經(jīng)肽等[4_5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)如5-羥 色胺(54iydroxytryptamine, 5-HT)、去甲腎上腺素 (norepinephrine, NA)和多巴胺的異常代謝可干擾神經(jīng) 突觸內(nèi)信息傳遞,進而使睡眠、情緒調(diào)控和學習記憶 等神經(jīng)活動受到影響。本研究通過觀察1,2-)CE 亞急性暴露對大鼠抑郁樣行為的影響,并觀察大鼠大 腦前額皮層、海馬紋狀體內(nèi)5~HT、NA和多巴胺水平 變化情況,為探討1,24)CE的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒作用機 制提供參考。

1材料和方法

1.1動物無特定病原體級雄性SD大鼠廣東省實 驗動物中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2013- 00002] 40只,體質(zhì)量180 ~220 g。大鼠飼養(yǎng)于廣東省 職業(yè)病防治院實驗動物屏障設施(無特定病原體級動 物房)內(nèi)實驗動物使用許可證號:SYXK (粵)2014- 0048],自由進食和飲水。本研究經(jīng)廣東省職業(yè)病防 治院實驗動物倫理委員會批準。

1.2儀器和試劑曠場實驗裝置、SuperMaze曠場試 驗視頻分析系統(tǒng)(XR-XZ301,上海欣軟信息科技有限公司);強迫 游泳實驗裝置為帶有高度標記的透明圓柱形游泳 ,上海欣軟信息科技有限公司);0. 22 pm濾膜(上 海安譜實驗科技有限公司;Agilent RX~C18色譜柱 (250. 0 mm X 3.0 mm X5. 0 pm)、Agilent 1260 液 相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);CoulochemM電化學 檢測器(美國ESA公司Millipore超純水機(美國 Millipore 公司。1,2~DCE (分析純,純度彡99. 50%, 廣州化學試劑廠);玉米油(益海嘉里食品營銷有限公 司);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);高氯 酸(優(yōu)級純,NA、-辛烷磺酸鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺 四乙酸二鈉、三乙胺(均為色譜純度5~HT、多巴胺(均 為分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乙腈 (色譜純美國賽默飛世爾科技公司蛋白沉淀液為 含濃度為0.100 mmol/L的高氯酸和體積分數(shù)為 0. 01%乙二胺四乙酸二鈉的水溶液。磷酸二氫鈉緩沖 溶液為含濃度分別為1. 700、25. 000、0. 025、0. 700 mmol/L1-辛烷磺酸鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸 二鈉和三乙胺的水溶液,pH值為3. 0)。

1.3動物分組與染毒大鼠經(jīng)檢疫并適應性飼養(yǎng) 1周后,采用隨機數(shù)表法分為對照組和低、中、高劑量 組,每組10只。本研究預實驗結(jié)果顯示,雄性SD大 鼠半數(shù)致死量為681 mg/kg體質(zhì)量。參照本課題組前 期研究8 ,本研究設計1,2~DCE染毒劑量在低、高 劑量組分別為20、40和80 mg/kg體質(zhì)量。實驗時,低、 中、高劑量組大鼠分別予質(zhì)量濃度為20、40、80 g/L1,2~DCE溶液(以玉米油配制)灌胃,灌胃體積為 1 mL/kg體質(zhì)量對照組大鼠給予等體積玉米油灌胃; 隔曰灌胃1次,共染毒14次。實驗期間觀察大鼠活 動、飲水飲食等情況。染毒結(jié)束時,3組大鼠共攝入相 當于0. 411、0.822、1.645倍半數(shù)致死量的1,2-DCE于末次染毒24 h后進行行為學測試。

1.4行為學測試

1.4.1曠場實驗實驗在4個涂黑敞箱內(nèi)進行,敞箱 底面等分成25個正方形。實驗在相對安靜的環(huán)境下 開始。將大鼠輕輕放入箱體中央,采集5 min內(nèi)大鼠 在箱內(nèi)的活動情況。中央和外周區(qū)域活動時間及路 程由Flyde-maze曠場試驗視頻分析系統(tǒng)記錄,直立次 數(shù)由未知實驗方案的研究人員記錄。

1.4.2糖水偏愛實驗實驗前進行大鼠糖水適應性 訓練:首先每籠放置2瓶糖水(質(zhì)量分數(shù)為1.00%), 1 d后改為1瓶糖水和1瓶純水,連續(xù)放置24 h。大鼠 經(jīng)適應性訓練后,禁食禁水1 d,開始糖水偏愛實驗。 實驗開始前稱量1瓶糖水和1瓶純水的質(zhì)量后將其放 入籠內(nèi)由大鼠隨意飲用;24 h,分別稱量糖水和純水的剩余質(zhì)量,計算消耗量,以分析大鼠的糖水偏愛度。 糖水偏愛度=糖水消耗量/總液體消耗量X100. 00%。 1.4.3強迫游泳實驗適應性訓練:實驗前1 d,將 約23 °C的水注入強迫游泳實驗裝置內(nèi),高度>30 cm; 將大鼠放入裝置,使其漂浮于水上,并使其下肢無法 觸及裝置底部以支撐其身體;當大鼠適應水溫和水環(huán) 境后,使其自由游泳6 min。24 h后,在相同的實驗條 件下,進行正式實驗,觀察時間為6 min,觀察期內(nèi)大 鼠在桶內(nèi)自由游泳。由未知實驗方案的研究人員記 錄大鼠2 ~6 min內(nèi)的不動時間。以大鼠停止任何掙 扎,漂浮于水面不動或僅做一些支持漂浮在水面的輕 微肢體活動定義為不動狀態(tài)。

1.5腦組織樣品采集及處理于行為學測試結(jié)束 后,將大鼠放入麻醉裝置中給予異氟烷吸入,麻醉后 經(jīng)腹主動脈采血,放血法處死。迅速取出全腦,于冰 上分離前額皮層、海馬和紋狀體等,置于凍存管,以液 氮迅速冷卻后,于-80 °C冰箱保存。檢測時,從冰箱 中取出凍存的組織樣品,稱質(zhì)量后置于勻漿器中,按 1 g :5 mL比例加入預先冷凍4 C的蛋白沉淀液體,冰 浴下快速勻漿2 min。勻漿液于4 C、4 000 xg離心 30 min,取上清液用0.22 pm濾膜過濾后,待測。

1.6腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測參照文獻 9],采用液相色譜-電化學檢測法測定1.5制 備的大鼠海馬、前額皮層和紋狀體樣品中5~HT、NA和 多巴胺水平。色譜條件:流速1.0 mL/min;進樣體積 20 pL;流動相組成A相(磷酸二氫鈉緩沖溶液B(乙腈=90 : 10 (V/V);柱溫35 C ;檢測電勢: Et = -150 V,E2 =220 V。該方法的 5-HT、NA 和多巴 胺水平檢出限分別為1. 1、1. 0、1. 1 pg/L,加標回收 率分別為 88. 60% ~ 94. 60%、93. 50% ~ 95. 10%、 89. 90% ~95.50%。

1. 7統(tǒng)計學分析采用SPSS 23. 0軟件進行統(tǒng)計分 析。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布,以x ± s描 述;多組組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間均 數(shù)兩兩比較方差齊時采用SNK檢驗,方差不齊時采用 Dennett T3法。采用兀線性回歸分析1,2—)CE染 毒劑量與單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平的劑量-效應關(guān)系;檢驗

水準a =0.05 (雙側(cè)

2結(jié)果

2.1基本情況對照組和低劑量組大鼠毛發(fā)光澤、 精神狀態(tài)、活動、飲水和攝食均正常;中劑量組和高劑 量大鼠分別于染毒第9天和第5天后可觀察到活動和 精神狀態(tài)異常持續(xù)至染毒結(jié)束,表現(xiàn)為精神萎靡、俯 臥、活動減少、弓背。染毒周期內(nèi)各組大鼠均無死亡。 2.2行為學實驗結(jié)果與對照組比較,中、高劑量組 大鼠直立次數(shù)、中心區(qū)域活動時間及路程均減少,糖 水偏愛度下降,游泳中的不動時間延長,差異均有統(tǒng) 計學意義(P <0.05)。見表1。

2.3 1,2—)CE暴露對大鼠不同腦區(qū)中單胺類神經(jīng)遞

質(zhì)水平的影響4組大鼠前額皮層、海馬和紋狀體中 5~HT、NA和多巴胺水平分別比較,差異均有統(tǒng)計學意 義(P <0.01)。兩兩比較結(jié)果見表2??梢?,高劑量 組大鼠3種腦區(qū)組織中5~HT、NA和多巴胺水平均低 于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。分別以 前額皮層、海馬和紋狀體的3種單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平 (y)1,2~DCE染毒劑量x)進行一元線性回歸分析, 結(jié)果顯示回歸方程均成立P< 0.01)。隨著

  • )CE染毒劑量的增加,前額皮層、海馬、紋狀體中 5~HT、NA和多巴胺水平均下降,均呈劑量-效應關(guān) 系。 見表 3。

1 4組大鼠行為學指標比較結(jié)果 x±s)

組別

動物數(shù)

直立次數(shù)

中心區(qū)域活動

中心區(qū)域活動

總路程

糖水偏愛度

不動時間

(只)

(次)

時間s)

路程mm)

(mm)

(%)

C s)

對照組

10

25.5±5.7

21.8±6.5

175.5±24.0

1 838.9 ±299.4

71. 00 ± 8. 60

50.1 ?1.8

低劑量組

10

24.6±4.0

20.0 ±4.5

180.3 ?7.5

1 897.2 ?68.3

68.50 ?.80

55.8 ?0.4

中劑量組

10

19.5?.1ab

15.0?.8ab

147.7?4.2ab

1 703.7 ?09.8

59.50?0.50a

64.0?.8a

高劑量組

10

17.4?.0ab

13.9?.7ab

140.7?6.4ab

1 616.2 ?46.4

59.30?1.30a

61.6?.9a

F

 

6.81

7.16

4.95

2. 04

4. 26

4. 36

P

 

<0.01

<0.01

<0.01

0. 12

0. 01

0. 01

注:與對照組比較,P <0.05;與低劑量組比較,bP <0. 05

 

 

2 4組大鼠前額皮層、海馬、紋狀體中5~HT、NA和多巴胺水平比較X御,ng/g)

組別

動物數(shù)

 

5-HT

 

 

NA

 

 

多巴胺

 

(只)

前額皮層

海馬

紋狀體

前額皮層

海馬

紋狀體

前額皮層

海馬

紋狀體

對照組

10

281.3±29.0

176.1 ?3.1

499.8?2.6

190.6±52.6

328.6 ?2.0

166.9?3.9

270.1 ?3.6

138.3?7.7

4738.2?25.5

低劑量組

10

266.2 ±32.8

159.1 ?6.9

471.2?3.4

179.3 ?2.2

323.0?1.4

161.9?6.5

256.3 ?0.8

121.9?9.2

4516.2?11.0

中劑量組

10

251.0±47.6

138.5?8.4a

335.9?5.6ab

122.6?4.8ab

253.0 ?7.4ab

109.7?0.5ab

249.6?2.1

112.1?1.5a

3 957.4?95.4a

高劑量組

10

194.1?1.9abc

102.4?6.5abc

328.4?9.4ab

119.8?3.7ab

239.8 ?3.0ab

97.4?7.9ab

172.2?1.2abc

74.9?0.0abc

3 182.4?505.7abc

F

 

9.78

14.57

19.98

6.37

4. 86

5. 48

10.16

18.71

10.86

P

 

<0.01

<0.01

<0.01

<0. 01

<0. 01

<0.01

<0.01

<0.01

<0.01

注:與對照組比較,aP<0.05;與低劑量組比較,bP<0.05;與中劑量組比較,cP<0.05

 

 

3 1,24)CE染毒與前額皮層、海馬、紋狀體5~HT、NA和多巴胺水平的劑量-效應關(guān)系分析結(jié)果

單胺神經(jīng)遞質(zhì)

 

回歸方程

決定系數(shù)

F

a

t

P2

5-HT

前額皮層

y =

-1.10 x

+286.67

0. 44

29.44

<0.01

30. 87

<0.01

海馬

y =

-0.93 x

:+ 176.55

0. 55

46.06

<0.01

28.14

<0.01

紋狀體

y =

-2.32 x

:+489.88

0. 49

36. 42

<0.01

27.86

<0.01

NA

前額皮層

y =

-0.96 x

+186.65

0. 27

14. 08

<0.01

15.94

<0.01

海馬

y =

-1.23 x

+ 329. 02

0. 24

11.79

<0.01

20.10

<0.01

紋狀體

y =

-0.95 x

+ 167. 38

0. 26

13. 58

<0.01

14.11

<0.01

多巴胺

前額皮層

y =

-1.23 x

+ 280. 08

0. 42

27.08

<0.01

25.88

<0.01

海馬

y =

-0.78 x

+139.18

0. 60

57. 60

<0.01

29.47

<0.01

紋狀體

y =

-20.17

x +4 804.44

0. 47

33.53

<0.01

30. 10

<0.01

:FPi值和t、P2值分別為回歸方程檢驗和回歸系數(shù)檢驗的結(jié)果

3討論

機體受到環(huán)境中病毒、細菌和有毒有害化學物質(zhì) 等因素影響后,在出現(xiàn)病理改變和臨床癥狀前通常會 出現(xiàn)行為功能障礙或其他指標異常;特定行為學的改 變能夠準確反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理或病理狀態(tài),可 作為神經(jīng)毒性的前期指標M。1,24)CE急性或亞急 性中毒主要臨床表現(xiàn)為中毒性腦病,腦水腫為主要病 理基礎(chǔ)tt1-12。1,24)CE中毒患者可出現(xiàn)頭暈、情感淡 漠、譫妄、抽搐、記憶力下降、反應遲鈍、計算力下降等 臨床癥狀M ;患者病情遷延,易反復或突然惡化,后遺 癥發(fā)生率及死亡率高對生命和健康影響極大。因 此,研究1,24)CE對神經(jīng)行為的影響對闡明其神經(jīng)毒 性具有重要意義。

本課題組前期的Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示,以 劑量為100和350 mg/m31,24)CE靜式吸入連續(xù)染 毒28 d,可引起小鼠空間學習和記憶能力下降,且隨 著染毒劑量增加和時間延長,其毒性效應增強M。楊 光謙等15的研究以劑量為1 200 mg/m31,2-)CE 靜式吸入染毒3 d,結(jié)果導致小鼠出現(xiàn)腦損傷,行為學 表現(xiàn)為抱爪現(xiàn)象。曠場實驗主要用于評價實驗動物 在新異環(huán)境(即開闊環(huán)境中的自主行為、探究行為與 緊張度16。糖水偏愛實驗可反映大鼠欣快感E7]。強 迫游泳實驗也被稱為絕望實驗,是經(jīng)典的抑郁類行為 學實驗,主要測量動物的活躍性;其中的漂浮行為被 用作分析“絕望”的參數(shù),因此也被認為是類似抑郁的 行為M。本課題組前期以劑量為79 mg/kg體質(zhì)量的

  • )CE隔日灌胃染毒大鼠4周(與本研究的1,24)CE 染毒劑量與染毒時間相近),結(jié)果顯示,大鼠出現(xiàn)易激 惹、弓背、活動減少、精神萎靡等活動異常°8 ;與本研 究觀察到的中、高劑量組大鼠行為學改變_致。但該 研究觀察到,大鼠的大腦、小腦皮質(zhì)與白質(zhì)組織病理學 檢查均未見明顯結(jié)構(gòu)性異常,亦未見出血、水腫與壞 死8 ;提示在該研究設計的1,24)CE染毒條件下,尚未 導致大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的腦水腫病理改變。在此基 礎(chǔ)上,本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,中、高劑量組大 鼠直立次數(shù)、中心區(qū)域活動時間和路程均減少(P < 0. 05),糖水偏愛度下降(P <0. 05),強迫游泳實驗中不 動時間延長P<0.05);提示1,2-)CE亞急性染毒可 導致大鼠的自發(fā)活動能力和探索能力降低,快感缺 失,求生yu望下降,出現(xiàn)類似抑郁癥狀。

職業(yè)性有機溶劑接觸可對職業(yè)工人的心理健康 狀況產(chǎn)生不同程度的損害。有研究結(jié)果顯示,苯系物 職業(yè)接觸可引起女性工人在人際關(guān)系敏感、抑郁、焦 慮、敵對4個因子評分上明顯上升E9];正已烷接觸工 人消極情緒(緊張-焦慮、抑郁-沮喪、憤怒-敵意、 疲憊-惰性、困惑-迷茫)得分升高,而心算平均準確 數(shù)、心算能力平均指數(shù)、聽數(shù)字廣度平均準確數(shù)、聽數(shù) 字廣度能力指數(shù)、曲線吻合平均準確數(shù)、曲線吻合平 均能力指數(shù)、目標追蹤平均準確數(shù)均下降M ; 1,24)CE中毒性腦病患者的焦慮和抑郁評分值明顯升 高M ;但機制尚不清楚。抑郁癥病因復雜,且受多種 環(huán)境、生理和心理性因素影響°22。目前抑郁癥病因機 制主要研究包括:炎癥假說、氧化應激假說、神經(jīng)營養(yǎng) 假說和神經(jīng)遞質(zhì)假說等^-25 ;其中以單胺神經(jīng)遞質(zhì) 假說為久遠成熟,該機制認為腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì) 如5~HT、NA多巴胺等的缺乏或代謝異常是導致抑郁 癥的主要因素^6-28。抑郁癥患者腦的結(jié)構(gòu)和功能 改變主要存在于前額皮層、海馬和紋狀體等29];而精 神活動的異常與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸內(nèi)的單胺類遞質(zhì) 5~HT、NA和多巴胺代謝水平失衡密切相關(guān)°9。本研 究發(fā)現(xiàn),隨著1,2~DCE染毒劑量增加,大鼠紋狀體、海 馬和前額皮層中5~HTNA和多巴胺均呈下降趨勢 (P<0.05);其中,高劑量組大鼠3個腦區(qū)中5~HT、NA 和多巴胺水平均低于對照組(P < 0. 05);提示

  • )CE誘導大鼠抑郁樣行為可能與單胺類神經(jīng)遞質(zhì) 水平的下降密切相關(guān)。

綜上所述,1,2—)CE亞急性暴露可誘導大鼠出現(xiàn) 抑郁樣行為,其機制可能與降低前額皮層、海馬和紋 狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平變化有關(guān)。但該機制 研究只是對神經(jīng)遞質(zhì)改變的初步探討,具體哪些相關(guān) 信號通路(蛋白和RNA)參與了該過程尚需進一步深 入研究。

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