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龜鹿二仙膠對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠行為學(xué) 及海馬GR、5-HT受體表達(dá)的影響
目的:觀察龜鹿二仙膠對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttraumatic stress disorder, PTSD)模型大鼠行為學(xué)，海馬糖皮質(zhì)激素受 體（glucocorticoid receptors, GR)及 5-羥色胺（5-iydroxytryptamine, 5-HT)受體 1A 亞型（5-HT1A)、2A 亞型（5-HT2A)表達(dá)的 影響。方法:采用單一延chang刺激方法制作大鼠PTSD模型,通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)以及Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠 的情感行為和學(xué)習(xí)記憶能力的改變。采用RTTCR法檢測(cè)海馬GR、5-iT1A和5-HT2A受體表達(dá)。結(jié)果:PTSD大鼠表現(xiàn) 出多種情感行為障礙，學(xué)習(xí)能力顯著降低（P <0.01)。海馬GR表達(dá)增強(qiáng)（P <0.01),5-HT1A受體表達(dá)下降（P <0.05), 5-HT2A受體表達(dá)則升高（P <0. 05)。龜鹿二仙膠(2.025 g ?kg ?1)和ying羊藿總黃酮（0. 06 g ?kg?1)能顯著改善PTSD大 鼠的情感行為障礙，提高學(xué)習(xí)記憶能力（P<0. 05或P<0. 01)。龜鹿二仙膠（2.025 g ?kg?1)和ying羊藿總黃酮（0.06 g ?kg1)可以明顯降低PTSD大鼠海馬GR的表達(dá)水平，升高5-HT1A受體表達(dá)水平和降低5-HT2A受體表達(dá)水平（P < 0.05或P<0.01)。結(jié)論:龜鹿二仙膠對(duì)PTSD具有良好的干預(yù)治療作用，其作用機(jī)理與改善情感行為和認(rèn)知功能以及調(diào) 節(jié)海馬GR、5-HT1A和5-HT2A受體表達(dá)有關(guān)。
近年來(lái)，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post~traumatic stress disorder, PTSD)的患病率呈逐年上升趨勢(shì)m。PTSD 屬于精神心理綜合征的范疇，是個(gè)體經(jīng)歷超常的威 脅性、災(zāi)難性的創(chuàng)傷事件后，呈現(xiàn)典型、常見(jiàn)的 身心障礙0。PTSD不僅給個(gè)人、家庭帶來(lái)極大負(fù) 擔(dān)，還進(jìn)一步影響著社會(huì)的穩(wěn)定和諧。中醫(yī)藥以其 *的理論和治法方藥在防治PTSD研究方面，顯 示出良好的應(yīng)用前景。本課題組以‘‘腎藏精，在志 應(yīng)恐”的中醫(yī)理論為指導(dǎo)，運(yùn)用龜鹿二仙膠開(kāi)展防 治PTSD的相關(guān)研究。初步的研究結(jié)果表明，龜鹿 二仙膠對(duì)條件性恐懼記憶的形成具有抑制作用H。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立PTSD大鼠模型，觀察大鼠行為學(xué)、 海馬糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor, GR)和 5-羥色胺（5~hydroxytryptamine, 5~HT)受體 1A 亞型 (5~HT1A)、A亞型（5~HT2A)表達(dá)的影響，進(jìn)一步 明確龜鹿二仙膠防治PTSD的效應(yīng)及其部分機(jī)理。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)藥物龜鹿二仙膠:產(chǎn)品購(gòu)自河南省新四 方制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z41022262,批號(hào): 090105,規(guī)格:每瓶200 g。ying羊藿總黃酮：產(chǎn)品購(gòu)自 陜西省西安市天園生物制劑廠，批號(hào):TY20090620, 規(guī)格:每瓶200 g。ying羊藿總黃酮用蒸餾水配制為 30 g • L-1的溶液，每次配制250 mL,置于4 °C冰箱 內(nèi)保存?zhèn)溆?。鹽酸氟西汀膠囊：產(chǎn)品購(gòu)自美國(guó)禮來(lái) 蘇州制藥有限公司，規(guī)格：每粒20 mg,批號(hào): 204362,用生理鹽水將膠囊內(nèi)粉末配制成0. 18 g • L-1混懸液,4 C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/span>
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) Sprague-Dawley (SD)雄性 大鼠,體質(zhì)量（180 ±20) g,購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)分別為： 0061199,0065089,0067723),自由飲食，在光暗周期 為12 h,溫度為（23 ±2) °C、通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)室條件 • 532 •
適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。每天輕撫大鼠5 min,使其逐漸適 應(yīng)實(shí)驗(yàn)者的操作。
1.3實(shí)驗(yàn)試劑Trizol提取總RNA試劑盒（美國(guó) Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄■聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒、 TaqDNA 聚合酶、dNTP、Access Quick™ RT-PCR sys-tem (美國(guó) Promega 公司）， SYBR Green 熒光染料 （美 國(guó) Gibco 公司），SYBR Green PCR Master Mix (美國(guó) MJ公司），PCR引物合成（上海生工生物工程技術(shù) 服務(wù)有限公司）。
1.4實(shí)驗(yàn)儀器XR-XZ301大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析系 統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），水迷宮Smart視 頻追蹤系統(tǒng)（San Diego Instrument,美國(guó)），LE-CEND MICRO 21R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Th ermo 公司，美 國(guó)），Prism 7000 型 Real-time Quantitative PCR system (MJ公司，美國(guó)）。
1.5實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組， 即對(duì)照組，模型組,龜鹿二仙膠高劑量組、低劑量組， ying羊藿總黃酮高劑量組、低劑量組，鹽酸氟西汀組。 對(duì)照組不應(yīng)激、不給藥，灌服等量生理鹽水;模型組 給予單_延chang刺激，不給藥，灌服等量生理鹽水。龜 鹿二仙膠高劑量組、低劑量組第1天造模，第2天開(kāi) 始每天分別給予龜鹿二仙膠1. 012 5 g • kg-1和 2.025 g • kg-1灌胃，連續(xù)14 d。ying羊藿總黃酮高劑 量組、低劑量組第1天造模，第2天開(kāi)始每天分別給 予ying羊藿總黃酮0. 03 g • kg-1和0. 06 g • kg-1灌 胃，連續(xù)14 d。鹽酸氟西汀組第1天造模，第2天開(kāi) 始每天給予鹽酸氟西汀1.8 mg • kg-1灌胃，連續(xù) 14 d。各組大鼠第16天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、拒俘反應(yīng)實(shí) 驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)等。
1.5.1 PTSD模型制作采用*的單一延
chang刺激（single-prolonged stress, SPS)造模方法，由 2005年日本文部省召開(kāi)的“基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)展” 會(huì)議確定4 ,單_延chang刺激處理步驟如下：將
大鼠禁錮2 h后，立即強(qiáng)迫游泳20 min (水溫25 °C , 水深40 cm),休息15 min后，yi醚麻醉至意識(shí)喪失, 不再給予任何刺激，在籠中自然蘇醒,常規(guī)飼養(yǎng)直至 取材。禁錮過(guò)程中采用的材料為錐體形的硬質(zhì)塑料 筒,其長(zhǎng)度和直徑可根據(jù)大鼠體形的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)。 大鼠尾部始終暴露在禁錮材料外，其軀干及四肢不 受壓迫，但無(wú)法自由活動(dòng)。
1.5.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)裝置包括曠場(chǎng)反應(yīng)箱和數(shù) 據(jù)自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)兩部分，大鼠曠場(chǎng)反應(yīng)箱內(nèi) 全涂黑，箱高40 cm,底邊長(zhǎng)100 cm,底面平均分設(shè) 25個(gè)小方格(4 cm X 4 cm),正上方2 m處固定數(shù)碼 攝像頭，視野范圍覆蓋曠場(chǎng)內(nèi)部。曠場(chǎng)白天光照由 兩側(cè)墻壁的4只節(jié)能燈發(fā)出約200 lux照度來(lái)模擬, 夜晚照明由一側(cè)墻的紅外光源提供。室內(nèi)隔音。觀 察5 min內(nèi)大鼠的行為表現(xiàn)，指標(biāo)包括水平活動(dòng)距 離，直立、呆滯、修飾行為次數(shù)，排便顆粒數(shù)。每次實(shí) 驗(yàn)均在上午7 : 00 -12 : 00進(jìn)行，兩次實(shí)驗(yàn)之間將 箱底打掃干凈。
1.5.3拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)用手套（大鼠從未接觸過(guò)） 輕抓大鼠，觀察并記錄其反應(yīng)。具體記分標(biāo)準(zhǔn)如下: 0分,很容易抓取;1分,尖叫或回避;2分，尖叫并回 避;3分,逃脫;4分，逃脫并尖叫；5分，試圖撕咬手 套;6分，主動(dòng)躍起攻擊。根據(jù)評(píng)分來(lái)評(píng)價(jià)大鼠恐懼 與沖突素質(zhì)特征改變5。
達(dá)RT~PCR法檢測(cè)。各組動(dòng)物麻醉后斷頭取腦， 在冰臺(tái)上快速分離海馬組織，置于-80 C冰箱保 存。使用的試驗(yàn)器材均經(jīng)滅活RNA酶處理。采用 Trizol總RNA提取試劑盒提取標(biāo)本中的總RNA,以 提取的總RNA為模板，按試劑盒說(shuō)明將總RNA逆 轉(zhuǎn)錄成cDNA后檢測(cè)海馬中GR、5-HT1A、5-HT2A 受體mRNA的表達(dá)量。PCR擴(kuò)增條件為：95 C10 min,95 C15 s,60 C20 s,72 C30 s,共 40 個(gè)循環(huán)。 建立雙標(biāo)準(zhǔn)曲線:取對(duì)照樣本cDNA, 10倍梯度稀釋 后，各取樣品2 ^L作為模板,然后用目的基因引物 和內(nèi)參基因引物分別進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在75 ~90 C 進(jìn)行溶解曲線分析，并繪制出目的基因和內(nèi)參基因 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各樣品cDNA進(jìn)行4倍梯度稀釋， 稀釋后取2卟作模板,分別用目的基因引物和內(nèi)參 基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在75 ~90 C分析溶解曲 線。采用 Prism 7000 型 Real~time Quantitative PCR 儀檢測(cè)，以管家基因甘油醛-3磷酸脫氫酶（glyceral- dehyde-5~phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內(nèi) 參，采用2-^法&]分析GR、5-HT1A、5~HT2A受體 的基因相對(duì)表達(dá)量。2- AACt法相對(duì)定量分析結(jié)果判 定：循環(huán)閾值。PCR引物序列：GAPDH上游：5'- ACATGCCGCGTGGAGAAACCT-3',下游:5'~GCCCA- GGATGCCCTTTAGTGG-3'; GR 上游：5'-AGCAGAG- AATGTCTCTAC-3',下游:5'~GGAATTCAATACTCAT- GGTC-3'; 5-HT1A 上游：5'-TCACCTGCGACCTGTT- TATC-3',下游:5'-GCTCCCTTCTTTTCCACCTT-3';5- HT2A 上游：5'-CATCATGGCAGTGTCCCTAG-3',下 游:5'-GGTAAATCCAGATCGCACAG-3'。
AQ = Ct樣品均值一Ct內(nèi)參均值
AACt = AQ - (Q陰性對(duì)照樣品均值-Ct內(nèi)參均值）
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20. 0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s)表示，組間比較采用 LSD法。P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較與對(duì)照組比較， 模型組大鼠在水平活動(dòng)距離，直立、呆滯、修飾行為 次數(shù)，排便顆粒數(shù)等方面均有顯著改變（P <0. 01); 龜鹿二仙膠(2.025 g • kg-1)和ying羊藿總黃酮（0.06 g • kg-1)對(duì)PTSD大鼠曠場(chǎng)行為學(xué)指標(biāo)均有顯著改 善（P <0.05 或 P <0.01)
PTSD的主要臨床表現(xiàn)包括創(chuàng)傷性事件的再體 驗(yàn)、持續(xù)性高警覺(jué)、閃回和麻木。單一延chang刺激造模 方法包含心理應(yīng)激（禁錮）、生理應(yīng)激（強(qiáng)迫游泳、yi醚麻醉），模擬出人類在自然環(huán)境中可能遭受到的
主要應(yīng)激類型，能使大鼠出現(xiàn)驚恐行為、活動(dòng)度降 低、學(xué)習(xí)和記憶能力減弱等多種PTSD樣的精神和 行為異常08 ,是目前較為成功的PTSD動(dòng)物模型。
曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)動(dòng)物情緒喚醒水平、神經(jīng)精神 變化的一種重要方法，對(duì)于量化分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精 神緊張度、警覺(jué)水平、焦灼狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力等具 有重要意義°3。本研究中曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和拒俘反應(yīng)實(shí) 驗(yàn)的結(jié)果顯示,PTSD大鼠活動(dòng)習(xí)性明顯改變、警覺(jué) 水平增高、環(huán)境適應(yīng)能力明顯下降，始終表現(xiàn)出受驚 嚇逃避的情感應(yīng)激反應(yīng)；拒俘反應(yīng)性呈現(xiàn)同步顯著 增強(qiáng)，容易激惹、掙扎行為明顯，沖突特性增強(qiáng)。 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PTSD大鼠逃避潛伏期 明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明其學(xué)習(xí)能力顯著降低,存在著顯著的 認(rèn)知功能障礙。
下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamus—)ituitary~ad- renal gland, HPA)軸是參與應(yīng)激反應(yīng)并對(duì)應(yīng)激進(jìn)行 有效調(diào)控的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。大量的研究已經(jīng)證 實(shí),PTSD患者存在著HPA軸功能的紊亂M。糖皮 質(zhì)激素是HPA軸分泌的主要應(yīng)激激素。 Quervain 等011通過(guò)臨床試驗(yàn)證實(shí)，提高體內(nèi)糖皮質(zhì)激素的水 平能夠抑制恐懼記憶的重現(xiàn)，從而減輕PTSD和恐 懼癥患者的癥狀。海馬是參與環(huán)境調(diào)控條件性恐懼 的重要腦區(qū)M ,同時(shí)也是HPA軸的重要調(diào)節(jié)位點(diǎn)。 海馬中的GR密度遠(yuǎn)高于其他腦區(qū)013 ,糖皮質(zhì)激素 通過(guò)與GR和鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效 應(yīng),GR在糖皮質(zhì)激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)以維持HPA軸 功能平衡中起著重要的作用M。
研究結(jié)果顯示,GR的表達(dá)水平升高015 ,本實(shí)驗(yàn) 的結(jié)果也顯示PTSD大鼠海馬GR的表達(dá)增強(qiáng)，這與 PTSD糖皮質(zhì)激素對(duì)HPA軸負(fù)反饋抑制作用增強(qiáng)是 —致的;而GR的高表達(dá)可能與PTSD的情感行為障 礙、認(rèn)知功能受損的發(fā)生發(fā)展過(guò)程有關(guān)。
關(guān)于PTSD的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但大量 文獻(xiàn)結(jié)果表明,5~HT水平異常與PTSD的發(fā)生密切 相關(guān)，抗抑郁藥5~HT重?cái)z取抑制劑作為治療PTSD 的shou選方案M。5~HT可能通過(guò)5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體、 5-HT受體以及與多巴胺、去甲腎上腺素等的相互作 用參與PTSD的發(fā)生017。海馬富含突觸后膜5- HT1A受體,5~HT1A受體和情感障礙關(guān)系非常密 切018。有研究表明，PTSD動(dòng)物5-HT1A受體活性 與下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素有關(guān)，并且參 與杏仁核神經(jīng)元凋亡過(guò)程13。研究表明，5~HT釋 放產(chǎn)生的焦慮效應(yīng)主要產(chǎn)生于5-HT2A受體的激 活。此外，應(yīng)激發(fā)生時(shí)5-HT還可能通過(guò)5-HT2A受 體發(fā)揮對(duì)HPA軸的調(diào)控作用020。單程長(zhǎng)時(shí)應(yīng)激2 周后，海馬腦區(qū)中5~HT2A受體親和力和受體數(shù)目 明顯增加；不可逃避刺激可使海馬、杏仁核以及下丘 腦5-HT2A受體表達(dá)呈升高趨勢(shì)020。臨床研究也 發(fā)現(xiàn),5~HT2A受體拮抗劑萘法唑酮對(duì)戰(zhàn)爭(zhēng)相關(guān)的 PTSD患者具有明顯改善作用021。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示,PTSD大鼠海馬5~HT1A受體表達(dá)下降，而5- HT2A受體表達(dá)升高，說(shuō)明單一延chang刺激應(yīng)激可能 通過(guò)影響5-HT1A受體和5-HT2A受體mRNA的表 達(dá)，進(jìn)而影響海馬對(duì)情緒反應(yīng)、學(xué)習(xí)記憶等的調(diào)節(jié)功 能，參與PTSD的一系列精神情感障礙以及認(rèn)知功 能減退等病理過(guò)程的發(fā)生。
PTSD屬于中醫(yī)情志病的范疇。中醫(yī)認(rèn)為，“腦 為髓之海’“腎主骨生髓’“腎藏精，在志應(yīng)恐”。因 此，腎可視為與恐相應(yīng)的機(jī)體情志活動(dòng)的儲(chǔ)備之臟， 而涵藏于腎中的精氣則是情志活動(dòng)*的物質(zhì)基 礎(chǔ)。腎中精氣充盈與否與機(jī)體情志活動(dòng)能否正常發(fā) 揮關(guān)系密切。基于中醫(yī)“腎藏精，在志為恐”理論， 筆者認(rèn)為，PTSD的發(fā)生是內(nèi)因和外因協(xié)同作用的結(jié) 果。外因主要源于外界重大創(chuàng)傷性事件的強(qiáng)烈刺 激，內(nèi)因主要由于稟賦不足或久病暗耗所致的腎精 不足，使機(jī)體應(yīng)對(duì)外界刺激的整體能力下降。精足 則神旺，腎精不足，腦髓失養(yǎng)，則易引發(fā)恐懼、焦慮、 抑郁、絕望等各種情志活動(dòng)的異常。腎藏志應(yīng)恐，驚 恐傷腎，氣機(jī)逆亂，則氣下精傷，志意失藏，進(jìn)而累及 五臟整體功能出現(xiàn)異常。因此,PTSD發(fā)病的中醫(yī)核 心病機(jī)凝煉為“腎精不足，封藏失職，志氣衰敗”。 有研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎方藥金匱腎氣丸可有效糾正地震 恐懼導(dǎo)致的子鼠神經(jīng)發(fā)育遲緩等，對(duì)受恐懼影響的 大鼠其血清皮質(zhì)酮、神經(jīng)遞質(zhì)（5~HT、DA)等出現(xiàn)的 代謝紊亂具有調(diào)節(jié)作用022 ,可明顯改善PTSD患者 對(duì)單一西藥治療藥物的依賴性和核心癥狀、抑郁和 焦慮狀態(tài)023 ;滋補(bǔ)腎精方藥能提高“恐傷腎”雌性小 鼠的雌二醇、促卵泡激素和黃體生成素水平024 ;溫 補(bǔ)腎陽(yáng)方藥能明顯改善PTSD大鼠Open-Field評(píng) 分、糖水?dāng)z取量、血漿17-)HCS及cAMP等025。
龜鹿二仙膠是中醫(yī)臨床治療各科虛證的基本 方，由鹿角膠、龜板膠、枸杞子、人參組成。鹿角膠能 補(bǔ)腎陽(yáng)、生精血;龜板膠能滋陰潛陽(yáng)，補(bǔ)血;人參大補(bǔ) 元?dú)舛?枸杞子益精生血。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎 填精、益氣養(yǎng)血、陰陽(yáng)并補(bǔ)之功效。我們前期研究工 作表明，龜鹿二仙膠能明顯抑制腎虛大鼠恐懼記憶 的形成,促進(jìn)恐懼消退02。本研究發(fā)現(xiàn)，在行為學(xué) 方面，龜鹿二仙膠能降低PTSD大鼠的高警覺(jué)水平 以及驚恐逃避情感反應(yīng)，提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力 和認(rèn)知功能。此外，龜鹿二仙膠可以降低PTSD大 鼠海馬GR的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)PTSD出現(xiàn)的HPA軸 功能紊亂；同時(shí)，龜鹿二仙膠還可通過(guò)升高PTSD大 鼠海馬5~HT1A受體表達(dá)水平和降低5~HT2A受體 表達(dá)水平，參與PTSD情感障礙的調(diào)節(jié)。
綜上，龜鹿二仙膠對(duì)PTSD具有良好的干預(yù)治 療效應(yīng),其作用機(jī)理與改善情感行為和認(rèn)知功能以 及調(diào)節(jié)海馬GR、5-HT1A和5-HT2A受體表達(dá)有關(guān)。
